本发明属于医药领域,涉及靶向人PTB(polypyrimidine tract-binding protein)蛋白的化合物MEAN(6-methoxyethylamino-numonafide)的新的药用用途,具体涉及靶向人PTB蛋白的新化合物MEAN在制备抗HBV的药物中的应用。结果表明,所述的MEAN化合物具有较强的抗病毒活性尤其是降低HBsAg表达量活性,和具有靶向PTB蛋白的作用。本发明的先导化合物具有较好的应用前景;所述的化合物可用于制备抗乙型肝炎病毒的药物,也可用于制备以PTB蛋白为靶标的药物。
1.式(1)所示化合物MEAN在制备抗HBV制剂或药物中的应用。ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="337"/>
2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于:所述抗HBV制剂或药物为抑制细胞分泌HBsAg的药物。
3.根据权利要求1所述的应用,其特征在于:所述抗HBV制剂或药物为抑制细胞分泌HBeAg的药物。
4.化合物MEAN在制备治疗乙型肝炎的制剂或药物中的应用。
5.根据权利要求1或2或3所述的应用,其特征在于:所述药物或制剂包括浓度为8μM,4μM或2μM的化合物MEAN。
6.根据权利要求5所述的制剂,其特征在于:所述制剂中化合物MEAN浓度为8μM。
7.化合物MEAN在制备以PTB蛋白为靶标的药物中的应用。
8.化合物MEAN在制备靶向人PTB蛋白的药物中的应用。技术领域
本发明属于医药领域,涉及靶向人PTB(polypyrimidinexa0tract-bindingxa0protein)蛋白的化合物MEAN(6-methoxyethylamino-numonafide)的新的药用用途,具体涉及靶向人PTB蛋白的新化合物MEAN在制备抗HBV的药物中的应用。
背景技术
已知乙型肝炎是严重威胁人类健康的传染病之一。乙肝病毒(Hepatitisxa0Bxa0Virus,HBV),属于噬肝性病毒科小DNA病毒。该病毒于1965年被丹娜(Dane)发现,并将其命名为丹娜(Dane)颗粒(Seegerxa0andxa0Mason2000)。HBV呈全球性分布,目前世界上约有3.5亿HBV慢性携带者,每年约有100万人死于HBV引起的疾病。我国属于HBV感染的高流行区域。2012年《中国卫生统计年鉴》显示,2011年病毒性肝炎的发病率是102.34/10万,死亡率是0.06/10万和病死率是0.34%,2011年病毒性肝炎发病人数是1372344人和死亡人数830人;其中,2007年《中国卫生统计年鉴》显示乙肝病毒表面抗原携带率高达9.8%,总人数高达1亿多人。核苷类药物(NAs)及干扰素是目前美国FDA批准可用于临床治疗乙型肝炎的两类药物。治疗目标应是最大限度地清除或长期抑制HBV,减轻肝细胞炎症坏死及肝纤维化,延缓和减少肝脏病理性恶化及其并发症的发生,从而改善生活质量和延长存活时间。HBV的持续存在和不断复制是导致病情进展的关键因素,因此,抗HBV治疗是控制乙肝病情发展的关键手段。由于慢性乙型肝炎感染需要长期应用,加之NAs耐药形势严峻,干扰素治疗无应答现象,严重地限制了这两类药物的使用。由于耐药性和免疫应答失败,加之cccDNA无法清除,这两类药物很难根治乙型肝炎。另外,HBV活动与宿主细胞密切相关,HBV在细胞内的寄生过程及后果既直接或间接影响宿主细胞的功能,也影响机体的整体功能。抑制HBV的复制循环过程不可避免地会影响正常细胞的功能,产生副作用。因此,目前医药界迫切的需求一种针对HBV感染的而且副作用较小的特效药物问世,以改善HBV相关恶性疾病的治疗效果。开发新靶标及非核苷类似物是解决上述问题的关键。目前尚未有非核苷类抗HBV小分子药物被批准用于HBV感染的治疗。随着人们对HBV发病机理的深入研究,抗HBV药物开发靶标已经从病毒吸附、DNA复制、组装、释放各个环节相关蛋白、酶等,延伸到人类自身相应靶标。人体内蛋白如(PTB)是HBV复制重要的辅助因子,体内试验发现PTB在黄病毒科内在性核糖体插入位点(internalxa0ribosomexa0entryxa0sites,IRES)调节的翻译起始中起着重要作用,PTB表达量减少可能是破坏HBV转录后调节元件(posttranscriptionalxa0regulatoryxa0element,PRE)功能的主要原因,干扰PTB辅助因子的功能,能有效的抑制HBV复制,因此以PTB为药物靶点,是开发新型抗HBV药物的理想方向。化合物MEAN(6-methoxyethylamino-numonafide)是新合成的一类numonafide化合物,该化合物的合成路径文献已有报道(Johnxa0T.Norton,Anti-Cancerxa0Drugs2008,19(11)),但其抗病毒活性未见报道,本发明提供化合物MEAN(6-methoxyethylamino-numonafide)抗HBV活性的新用途。化合物MEAN(6-methoxyethylamino-numonafide)的结构式如下:ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="409"/>分子量:342.18。
发明内容
本发明的目的是要提供具有靶向人PTB的抗HBV功能的化合物MEAN的应用。式(1)所示化合物MEAN(6-methoxyethylamino-numonafide)在制备抗HBV制剂或药物中的应用。ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="341"/>化合物MEAN在制备抑制细胞分泌HBsAg的药物中的应用。化合物MEAN在制备抑制细胞分泌HBeAg的药物中的应用。化合物MEAN在制备治疗乙型肝炎的制剂或药物中的应用。一种抗HBV制剂,包括浓度为8μM,4μM或2μM的化合物MEAN。优选的,所述制剂中化合物MEAN浓度为8μM。该优选浓度,为在安全剂量下抑制病毒效果最明显的浓度。化合物MEAN在制备以PTB蛋白为靶标的药物中的应用。化合物MEAN在制备以人PTB蛋白为靶标的药物中的应用。本发明在细胞水平对MEAN化合物进行抗HBV复制抑制实验,检测MEAN是否抑制病毒,发现MEAN能抑制HBV表面抗原(HBsAg)和E抗原(HBeAg)分泌到上清,然后用westernxa0blotting检测MEAN能下调PTB表达。结果表明,所述的MEAN化合物具有较强的抗病毒活性尤其是降低HBsAg表达量活性,和具有靶向PTB蛋白的作用。本发明的先导化合物具有较好的应用前景;所述的化合物可用于制备抗乙型肝炎病毒的药物,也可用于制备以PTB蛋白为靶标的药物。本发明的化合物MEAN可作为先导化合物进一步的结构优化,制备抗HBV活性的制剂或药物。本专利报道MEAN体外影响作为DNA病毒的HBV感染细胞模型的PTB蛋白表达量,而已有文献报道MEAN能体外抑制RNA病毒感染细胞模型的PTB从细胞核向细胞质转位,从而抑制RNA病毒的复制。本发明的靶向人PTB蛋白的MEAN化合物的优点有:1、具有较强的抗HBV活性和靶向PTB蛋白的作用;2、所述的MEAN化合物可用于制备抗HBV活性或治疗乙型肝炎的制剂或药物;3、以及用于制备以PTB蛋白为靶标的药物。
附图说明
图1显示了本发明的MEAN化合物对HepG2.2.15细胞的毒性影响。图2显示了本发明的MEAN化合物对HepG2.2.15细胞中HBVxa0DNA的抑制作用,结果发现HBV抑制效果不是很显著。图3显示了本发明MEAN化合物对HepG2.2.15细胞中HBeAg的抑制作用,其中,8μM浓度对HBeAg抑制效果较好。图4显示了本发明的MEAN化合物对HepG2.2.15细胞分泌HBsAg的影响,其中,8μM,4μM和2μM浓度对HBsAg抑制效果都较好,而且呈剂量依赖效应。图5显示了本发明所述的化合物对HepG2.2.15细胞中PTB蛋白的抑制作用,结果显示MEAN明显下调细胞内PTB蛋白表达量。具体实施例为了便于理解,以下将通过具体的附图和实施例对本发明的靶向人PTB蛋白的MEAN化合物进行详细地描述。需要特别指出的是,具体实例和附图仅是为了说明,显然本领域的普通技术人员可以根据本文说明,在本发明的范围内对本发明做出各种各样的修正和改变,这些修正和改变也纳入本发明的范围内。下列实施例中所用方法如无特别说明,均为常规方法。以下实施例中所需要的材料或试剂,如无特殊说明均为市场购得。化合物MEAN(6-methoxyethylamino-numonafide)的合成路径文献已有报道(Johnxa0T.Norton,Anti-Cancerxa0Drugs2008,19(11))。实施例中的数据分析采用SPSS16.0统计分析软件进行单因素方差分析和One-Wayxa0ANOVA多组比较。实施例1目标化合物对HBVxa0DNA复制的影响如图1所示,40μM和20μM化合物对HepG2.2.15细胞有毒性,10μM对HepG2.2.15细胞无毒性,IC50是14.89μM。因此采用10μM或及以下浓度作为干预浓度来测定抗HBV药效。化合物以8μM,4μM和2μM浓度干预HepG2.2.15细胞2d,采用荧光定量PCR法检测细胞上清液中HBVxa0DNA水平。所用的仪器是ABI7500型实时荧光定量PCR系统。具体步骤按照乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒的说明书操作,简要描述如下:用试剂盒的核酸抽提液抽提细胞培养上清的病毒DNA,然后以病毒DNA为模板,配制的反应体系包括荧光定量PCR反应液、引物和探针等组分。PCR反应条件为预变性95°C3min;变性95°C10s,退火延伸和荧光采集60°C35s,共40个循环。如图2所示,与空白对照组相比,MEAN抑制病毒效果无显著性差异。实施例2目标化合物对HBeAg分泌表达的影响将化合物以8μM,4μM和2μM浓度干预HepG2.2.15细胞2d,采用电化学发光技术检测细胞上清液中HBeAg水平,所用的仪器是Abbottxa0Architectxa0I2000sr(Abbott),所用的试剂是跟Abbottxa0Architectxa0I2000sr仪器配套的乙肝HBeAg定量检测说明书(Abbott),具体步骤按照说明书操作。如图3所示,与空白对照组相比,8μM化合物MEAN对HBeAg抑制效果有显著性差异,其它浓度无显著性差异。目标化合物对HBsAg分泌表达的影响将化合物以8μM,4μM和2μM浓度干预HepG2.2.15细胞2d,采用电化学发光技术检测细胞上清液中HBsAg水平,所用的仪器是Abbottxa0Architectxa0I2000sr(Abbott),所用的试剂是跟Abbottxa0Architectxa0I2000sr仪器配套的乙肝HBsAg定量检测说明书(Abbott),具体步骤按照说明书操作。如图4所示,与空白对照组相比,8μM,4μM和2μM浓度都对HBsAg抑制效果较好,与空白对照组相比有显著性差异,而且呈剂量依赖效应,在安全剂量范围内,8μM是优选浓度,抑制病毒HBsAg效果最明显。实施例3目标化合物对PTB蛋白表达的影响Westernxa0Blot检测PTB蛋白表达水平。提取细胞总蛋白并按照BCA蛋白定量试剂盒的操作说明进行定量分析。取上述细胞总蛋白40μg使用SDS-PAGE分离并转移到硝酸纤维素膜上。1%牛血清白蛋白封闭后,将膜与抗体PTB(自制)及β-actin(Cellxa0signalingxa0technology)4°C孵育过夜,二抗孵育1小时后用化学发光试剂ECL(Pierce)检测。如图5所示,与空白对照组相比,MEAN能显著下调细胞内PTB蛋白表达量,具有显著性差异。与文献报道不同的是,对于RNA病毒,MEAN能体外抑制RNA感染细胞模型的PTB胞核-胞质转位,但不能抑制PTB总蛋白的表达。